一、目的
通過在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行無菌操作訓(xùn)練，初步掌握組織培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)及外植體的消毒滅菌技術(shù)
二、原理
滅菌是組織培養(yǎng)中重要的工作環(huán)節(jié)之一，是指采用理化手段殺死物體表面及其孔隙內(nèi)的一切微生物，包括細(xì)菌的芽孢和真菌的孢子。組織培養(yǎng)中要求無菌室、超凈工作臺(tái)達(dá)到無菌狀態(tài)，植物材料也要經(jīng)過消毒滅菌后再接種，接種人員的雙手同樣如此。
無菌室和超凈工作臺(tái)可采用甲醛、高錳酸鉀混合薰蒸，結(jié)合紫外燈照射20～30分鐘；外植體可采用70%酒精和10%的次氯酸鈉殺菌；雙手可用70%的酒精棉球擦拭；接種工具可采用70%酒精棉球擦拭，再經(jīng)火焰灼燒滅菌。
MS培養(yǎng)基中包含有植物生長(zhǎng)所需的各種營(yíng)養(yǎng)元素，可為離體培養(yǎng)的生物材料提供近似于生物體內(nèi)及外界生長(zhǎng)生存的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。當(dāng)植物材料滅菌后即可在適宜的培養(yǎng)基、適宜的溫度條件下生長(zhǎng)。
三、試劑及器材
超凈工作臺(tái)、酒精燈、鑷子、無菌培養(yǎng)皿、無菌濾紙、無菌蒸餾水、無菌小燒杯、10%次氯酸鈉、70％乙醇、廢液缸、酒精棉球、打火機(jī)
四、操作
（1）準(zhǔn)備工作：配制MS基本培養(yǎng)基，備用。
（2）用酒精棉球?qū)?a title="超凈臺(tái)" href="http://m.gzhaik.com/" target="_blank">超凈臺(tái)的操作表面擦拭干凈。
（3）將實(shí)驗(yàn)器材及試劑放入超凈工作臺(tái)中，紫外滅菌25－30min。
（4）滅菌后打開超凈風(fēng)，吹5min。
（5）洗凈雙手，進(jìn)入無菌室。在超凈臺(tái)內(nèi)點(diǎn)燃酒精燈，用酒精棉球反復(fù)擦拭雙手，尤其要注意關(guān)節(jié)部位；超凈臺(tái)的表面也要用酒精棉球單方向擦拭（一般由里到外）。
（6）取適量種子置于100/50ml燒杯中，用70%的乙醇消毒30s-1min，然后將酒精倒入廢液缸中，加入無菌水，輕輕晃動(dòng)，清洗1-2min后，將無菌水倒入廢液缸中。
（7）將10%次氯酸鈉(NaClO)加入燒杯中，消毒10 min，期間不時(shí)晃動(dòng)燒杯，使種子充分接觸消毒劑；然后將NaClO溶液倒入廢液缸中，加入無菌水，輕輕晃動(dòng)，清洗3-4min后傾去，如此重復(fù)3-4次。
（8）將種子置于墊有濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，吸干種子表面的水分。在整個(gè)操作過程中鑷子和解剖刀要多次火焰消毒，冷卻后再使用。
（9）接種：每瓶接種種子10粒。接種時(shí)，應(yīng)在酒精燈旁操作，錐形瓶口應(yīng)斜向火焰；接種好后，將錐形瓶的瓶口在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)動(dòng)地?zé)槐椋馍w瓶口，然后用線繩將瓶口扎牢，以免微生物進(jìn)入，造成污染，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。
（9）接種結(jié)束后，清理和關(guān)閉超凈工作臺(tái)。
（10）將培養(yǎng)瓶放置于25℃光照培養(yǎng)箱/培養(yǎng)室培養(yǎng)并觀察。
五、結(jié)果
1、觀察種子的生長(zhǎng)情況。
2、統(tǒng)計(jì)污染率、污染種類。